Згубні залежності 

Синтез гіалуронової кислоти. Будова та застосування в медицині гіалуронової кислоти. Фізіологічна роль гіалуронових полімерів

Гіалуронова кислота [ГК] знайдена у позаклітинному матриксі хребетних тканин, у поверхневому покритті певних видів Streptococcus та хвороботворних бактеріальних мікроорганізмів Pasteurella, а також на поверхні деяких частково уражених вірусом морських водоростей. Синтази гіалуронової кислоти [ГКС] це ферменти, які полімеризують ГК, використовуючи UDP-цукрові попередники, які знайдені у зовнішніх мембранах цих організмів. Були ідентифіковані гени кортикостероїдів з усіх вищезгаданих джерел. Здається, існують два відмінні класи глюкокортикоїдів, що засновано на відмінностях в амінокислотній послідовності, передбаченій топології в мембрані та передбачуваному механізмі реакції.

Всі кортикостероїди були визначені як синтази класу I, за винятком кортикостероїдів у виду Pasteurella. Було також пояснено каталітичний спосіб роботи єдиної кортикостероїдів класу II (пмГКС). Цей фермент подовжує зовнішні ГК-приєднуються олігосахаридні акцептори шляхом додавання індивідуальних моносахаридних одиниць до кінця, що не зменшується, сформувати довгі полімери in vitro; жодна глюкокортикостероїд класу I не має такої здатності. Спосіб та напрямок полімеризації ДК, що каталізується ГКС класу I, залишаються неясними. Фермент пмГКС також був проаналізований на предмет двох наявних у нього активностей: GlcUA-трансферазної та GlcNAc-трансферазної. Таким чином, дві активні ділянки існують в одному поліпептиді пмГКС, спростовуючи широко прийняту догму глікобіологи: "один фермент - один модифікований цукор". Попередні свідчення дозволяють припускати, що у ферментів класу I може бути дві ділянки активності.

Каталітичний потенціал ферменту пмГКС може використовуватися для створення нових полісахаридів або проектування олігосахаридів. Через безліч потенційних ГК-базуючих медичних методів лікування, ця хемоензіматична технологія обіцяє принести користь на шляху нашого прагнення до хорошого здоров'я.

Ключові слова

Гіалуронова кислота (ГК), хондроїтин, глікозилтрансфераза, синтаза, каталіз, механізм, химерні полісахариди, монодисперсні олігосахариди

Вступ

Гіалуронан [ГК] - дуже багатий глюкозаміноглікан в організмі хребетних, що має і структурну, і сигнальну ролі. Певні патогенні бактерії, а саме, групи А і С виду Streptococcus і тип Pasteurella multocida, виробляють позаклітинний покриває ГК, званий капсулою. В обох видів ГК капсула і є фактором отруйності, який забезпечує бактеріям опір фагоцитів і комплементарність. Інший організм, що виробляє ГК – це морська водоростя хлорела, інфікована певним великим дволанцюжковим ДНК-вірусом PBCV-1. Роль ГК у життєвому циклі цього вірусу поки що не зрозуміла на даний момент.

Ілюстрація 1. Реакція біосинтезу ГК.

Ферменти класу глікозилтрансфераз, які полімеризують ГК, називаються ГК-синтазами (або кортикостероїдами), за старою термінологією, що включає також ГК-синтетази. Всі відомі ГК-синтази – це різновиди одного поліпептиду, відповідальні за полімеризацію ланцюга ГК. UDP-цукрові попередники, UDP-GlcNAc та UDP-GlcUA використовуються ГК-синтазами у присутності двовалентного катіону (Mn та/або Mg) при нейтральному pH (рис. 1). Всі синтази є мембраннозв'язаними білками в живій клітині і виявлені в мембранній фракції після лізису клітин.

Між 1993 - 1998 були ідентифіковані та клоновані на молекулярному рівні ГК-синтази груп A і C Streptococcus [спГКС та сеГКС відповідно], ГК-синтази хребетних тварин [ГКС 1,2,3], ГК-синтаза водоростевого вірусу [свГКС], а також ГК-синтаза типу A виду Pasteurella multocida [ПМГКС]. Перші три типи ГК-синтаз, здається, дуже схожі у розмірі, амінокислотної послідовності та передбачуваної топології в мембрані. ГК-синтаза виду Pasteurella, навпаки, більше і має суттєву відмінність від інших синтаз послідовністю та передбаченою топологією. Тому ми припустили існування двох класів ГК-синтаз (таблиця 1). Ферменти класу I включають стрептококові, хребетні та вірусні білки, тоді як білок виду Pasteurella в даний час є єдиним членом класу II. У нас також є деякі свідчення того, що каталітичні процеси ферментів класу І та класу II відрізняються.

Таблиця 1. Два класи ГК-синтаз:

Хоча ГК-синтаза виду Pasteurella був останнім виявленим ферментом з усіх, деякі особливості пмГКС сприяли суттєвому просуванню у його вивченні порівняно з деякими членами ферментів класу I, які досліджувалися чотири десятиліття. Ключова особливість пмГКС, яка дозволила роз'яснити молекулярний напрямок полімеризації та ідентифікацію її двох активних ділянок - це здатність пмГКС подовжувати зовні розташований акцепторний олігосахарид. Рекомбінантна пмГКС додає одиночні моносахариди повторним способом до ГК-асоційованого олігосахариду in vitro. Внутрішня особливість кожної передачі моносахариду відповідальна для того, щоб формувати альтернативне повторення дисахаридів у цьому глюкозаміноглікані; одночасне формування дисахаридної одиниці не потрібне. З іншого боку, ніяке подібне подовження зовнішніх акцепторів був доведено ні якого ферменту класу I. Через фундаментальне наукове дослідження ми тепер розвинули деякі біотехнологічні застосування чудового білка класу ГК-синтаз виду Pasteurella.

Матеріали & методи

Реагенти

Всі реактиви для молекулярно-біологічних досліджень без спеціальної позначки були від Promega. Стандартні олігонуклеотиди були від Great American Gene Company. Всі інші реактиви високої чистоти, якщо не помічено, були від Sigma або від Fisher.

Усічення пмГКС та точкові мутанти

Був проведений ряд усічених поліпептидів, шляхом ампліфікації pPm7А вставки методом полімеразної ланцюгової реакцією з Taq-полімеразою (Fisher) та синтетичними олігонуклеотидними праймерами, що відповідають різним частинам пмГКС, з відкритою рамкою зчитування. Амплікони потім клонували в плазміду для експресії pKK223-3 (tac промотор, Pharmacia). Отриманими рекомбінантними конструкціями були трансформовані клітини Escherichia coli штаму TOP 10F" (Invitrogen) і вирощені на середовищі LB (Luria-Bertani) з ампіцилінової селекцією. Мутації були зроблені, використовуючи метод QuickChange сайт-направленого шаблон.

Приготування ферменту

Для виготовлення мембрани, що містить рекомбінантний пмГКС повної довжини, пмГК1-972 був ізольований з E.coli, як описано. Для розчинних усічених пмГКС білків, пмГКС1-703, пмГКС1-650 і пмГКС1-703 - містять мутантів, клітини були витягнуті за допомогою В-PerTM II Bacterial Protein Extraction Reagent (Pieree) згідно з інструкцією виробника, за винятком того, що процедур 7°C у присутності інгібіторів протеаз.

Ферментні шляхи полімеризації ГК. GlcNAc модифікація або GlcUA модифікація

Три варіанти було розроблено, щоб виявити чи відбувається (а) полімеризація довгих ланцюгів ГК або (b) додавання одиночного GlcNAc до GlcUA-кінцевого акцепторного олігосахариду ГК , або (c) додавання одиночного GlcUA до GlcNAc-кінцевого акцепторного олігосахариду ГК. Повна активність глюкокортикоїдів була оцінена для розчину, що містить 50 mM Tris, pH 7.2, 20 mM MnCl2, 0.1 M (NH4)2SO4, 1 M етиленгліколю, 0.12 mM UDP-(14C)GlcUA (0.01 μCi;-NEN) GlcNAc та різний набір ГК олігосахаридів, отриманий з тестикул шляхом обробки гіалуронідазою [(GlcNAc-GlcUA)n, n= 4-10] при 30°C протягом 25 хвилин в об'ємі реакційної суміші 50 мкл. GlcNAc-трансферазна активність була оцінена протягом 4 хвилин у тій же буферній системі з різним набором ГК олігосахаридів, але тільки з одним цукром у ролі попередника - 0.3 mM UDP-(3H)GlcUA (0.2 μCi; NEN). GlcUA-трансферазна активність була оцінена протягом 4 хвилин у тій же буферній системі, але тільки з 0.12 mM UDP-(14C)GlcUA (0.02 μCi) і з непарним набором ГК олігосахаридів (3.5 мкг уронової кислоти), приготовлених за допомогою впливу ртуті на ГК-ліазу Streptomyces. Реакції було припинено шляхом додавання SDS до 2% (w/v). Продукти реакції були відокремлені від субстратів шляхом паперової (Whatman 3M) ​​хроматографії з етанолом/1 М сульфат амонію, pH 5 5, як основний розчинник (65:35 для кортикостероїдів та оцінки GlcUA-Tase; 75:25 для оцінки GlcNAc-Tase). Для оцінки глюкокортикостероїдів зразок паперової смуги був промитий водою, і об'єднання радіоактивних цукрів у полімер ДК було виявлено по сцинтиляції рідини, розрахованої за допомогою BioSafe II коктейлю (RPI). Для реакцій напіввипробування зразок і розташовані вниз за течією 6 см смуги були пораховані частинами 2 см. Всі оціночні експерименти були прораховані таким чином, щоб бути лінійними щодо часу інкубації та концентрації білка.

Гель-фільтраційна хроматографія

Розмір ГК полімерів проаналізовано хроматографічно на колонках Phenomenex PolySep-GFC-P 3000, елюція вироблялася 0.2 M нітратом натрію. Колонка була стандартизована флуоресцентними декстранами різного розміру. Радіоактивні компоненти були виявлені за допомогою датчика LB508 Radioflow (EG&G Berthold) та коктейлю Zinsser. У порівнянні з повною оцінкою кортикостероїдів, використовуючи паперову хроматографію, описану вище, ці 3-хвилинні реакції містили двічі UDP-цукрові концентрації, 0.06 μCi UDP-(14C)GlcUA і 0.25 нанограма ряду ГК олігосахаридів. Крім того, використовувалося додавання киплячого (2 хвилини) етилендіаміну тетрацилової кислоти (фінальна концентрація 22 mM), щоб закінчити реакції замість додавання SDS.

Результати та обговорення

Утилізація та специфічність акцептора кортикостероїдів

Деякі олігосахариди були перевірені як акцептори для рекомбінантного пмГКС1-972(Таблиця 2). ГК олігосахариди були отримані з тестикул шляхом гіалуронідазного прищеплення, а подовжені пмГКС за допомогою відповідних UDP-цукорів. Відновлення борогідрат натрію не порушує активність акцептора. З іншого боку, олігосахариди, отримані з ГК за допомогою відщеплення ліазою, не підтримують подовження; дегідратовані ненасичені невідновлені кінцеві залишки GlcUA потребують гідроксильних груп, які змогли б приєднати вхідний цукор з UDP-попередника. Тому пмГКС-каталізується подовження відбувається у разі невідновлених кінцевих груп. У ряді паралельних експериментів було виявлено рекомбінантні форми синтаз класу I - спГКС та х1ГКС, які не подовжують ГК-одержувані акцептори. Зважаючи на напрямок активності ферментів класу I, суперечливі повідомлення були зроблені та необхідні подальші дослідження.

Таблиця 2. Специфіка олігосахаридних акцепторів пмГКС:

Цікаво, що хондроїтин сульфат пентамер є добрим акцептором для пмГКС. Інші структурно пов'язані олігосахариди такі, як хітотетроза або хепарозан пентамер, однак не служать акцепторами для пмГКС. В цілому, пмГКС, здається, вимагає, β-пов'язаних GlcUA-містять акцепторних олігосахаридів. Ми висуваємо гіпотезу, що ділянка зв'язування олігосахаридів проміжна в ланцюзі утримання ГК під час полімеризації.

Молекулярний аналіз активності пмГКС трансферази: дві активні ділянки в одному поліпептиді

Можливість виміряти два компоненти глікозилтрансферазної активності ГК синтази, GlcNAc-трансферазу та GlcUA-трансферазу, дозволив молекулярний аналіз пмГКС. Ми відзначили, що короткий дубльований мотив послідовності: Asp-Gly-Ser (Аспарагінова к-та-Гліцин-Серін), був присутній у пмГКС. З аналізу порівняння гідрофобних груп багатьох інших глікозилтрансфераз, які виробляють β-пов'язані полісахариди або олігосахариди припустили, що взагалі існує два типи доменів: області "A" і "Б". ПмГКС, синтаза класу II, тим і є унікальною, що містить два "А" домени (особиста комунікація, B.Henrissat). Було запропоновано, що певні члени класу I ГК синтаз (СПГКС) містять одиночні "А" та одиночні "Б" області. Різне видалення або точкові мутанти пмГКС були оцінені для їхньої здатності полімеризувати ЦК ланцюга або їх здатність додавати одиночний цукор до ЦК акцепторного олігосахариду (Таблиця 3). Підсумовуючи сказане, пмГКС містить дві відмінні один від одного активні ділянки. Мутагенез аспартату мотиву DGS (залишок 196 або 477) на обох сайтах призводи до втрати ГК полімеризації, але активність іншого сайту залишалася відносно незачепленою. Таким чином, подвійна активність ГК синтази була перетворена на дві різні одиночні дії глікозилтрансферази.

Таблиця 3. Активність пмГКС із віддаленою ділянкою або точковою мутацією.

Видалення останніх 269 залишків від кінцевої карбоксильної групи перетворило слабо виражений мембранний білок добре виражений розчинний. Розгляд амінокислотної послідовності білка пмГКС у цій галузі, однак, не показує типових особливостей вторинної структури, які б забезпечили пряму взаємодію ферменту з подвійним шаром ліпіду. Ми висуваємо гіпотезу, що кінцева карбоксильна група каталітичного ферменту пмГКС стикується з направляючим мембранозв'язаним полісахаридом транспортного апарату бактеріальної клітини, що живе.

Перша "A" область пмГКС, А1 є GlcNAc-тазою, у той час як друга "A" область, A2, є GlcUA-тазою (рис. 2). Це перша ідентифікація двох активних ділянок для ферменту, який виробляє гетерополісахарид, так само як ясний доказ, що один фермент може дійсно передати два різні цукру. Відмінний від типу F фермент виду P. multocida, названий пмЦС, був знайдений, і з'ясовано, що каталізує формування несульфатируемого полімеру хондроїтину. ГК та хондроїтин ідентичні в структурі, за винятком згаданого вище полімеру, який містить N-ацетилглюкозамін замість GlcNAc. І пмГКС, і пмЦС на 87% ідентичні лише на рівні амінокислот. Більшість змін у залишках перебувають у області А1, що цілком сумісне з гіпотезою у тому, що це область відповідальна за передачу гексозаміну.

2. Схематичне зображення пмГКС областей.
Два незалежні трансферазні домени, А1 і A2, відповідальні за каталіз полімеризації ланцюга ГК. Послідовні додавання одиночних цукрів, що повторюються, швидко будують ланцюг ГК. Схоже, що карбоксильний кінець пмГКС деяким способом взаємодіє з мембраннозв'язаним транспортним апаратом бактеріальної клітини.

Ілюстрація 3. Модель біосинтезу ГК з допомогою пмГКС.
Одиночні цукру додаються до кожного "A" домену повторним способом до кінця ланцюга ГК, що не відновлюється. Внутрішня точність кожної стадії активності трансферази підтримує повторення структури дисахаридів ГК. Виникає ланцюг ГК ймовірно зберігається пмГКС під час каталізу через олігосахарид-зв'язуючу ділянку.

Ми продемонстрували ефективну передачу одиночного цукру за допомогою пмГКС in vitro декількома типами експериментів, тому ми висунули гіпотезу, що ланцюги ГК формуються швидким, повторюваним додаванням одиночного цукру синтазою класу II (рис. 3). До теперішнього часу, одна лінія свідоцтва передбачає, що фермент класу I також має дві ділянки трансферази. Мутація лейцинового залишку 314 на валін у ммГКС1, в частині попередньої ділянки GlcUA-тази, як повідомляли, перетворила цю глюкокортикостероїдну хребетну тварину в хіто-олігосахаридну синтазу. Жодна ділянка з відповідною активністю GlcNAc-трансферази не була ідентифікована.

Щеплення полімеру полісахаридними синтазами: додавання ГК до молекул або твердих частинок

Дослідження ПМГКС у науково-дослідній лабораторії перетворило уявлення про ГК синтази від царства важких, затятих тваринноподібних чудовиськ до потенційних біотехнологічних робочих коней. Нові молекули можуть бути сформовані, використовуючи здатність пмГКС прищепити довгі ланцюги ГК на коротких ГК отриманих ланцюгах або хондроїтин-похідних акцепторах. Наприклад, корисні акцептори можуть складатися з маленьких молекул або ліків з ковалентно пов'язаною ГК або хондроїтин-олігосахаридні ланцюги (довжиною 4 цукру, наприклад). В іншому випадку ланцюги ГК можуть бути додані до олігосахаридного праймера, іммобілізованого на твердій поверхні (таблиця 4). Таким чином, довгі ланцюги ГК можуть бути додані до чутливих речовин або тонких пристроїв.

В іншому додатку нові химерні полісахариди можуть бути сформовані тому, що використання пмГКС олігосахаридним акцептором не настільки ж строго, як сахаридна трансферазна специфіка. Хондроїтин та хондроїтин-сульфат визнані як акцептори пмГКС та подовжуються ГК ланцюгом різних довжин (рис. 4). Навпаки, пмЦС дуже гомологічна хондроїтин синтазе, розпізнає та подовжує ГК акцептори ланцюгами хондроїтину. Химерні молекули глюкозаміноглікану сформовані, містять природні, певного з'єднання зв'язку. Ці щеплені полісахариди можуть служити, щоб приєднатися до клітини або тканини, яка зв'язує ГК з іншою клітиною або тканиною, що зв'язує хондроїтин або хондроїтин-сульфат. У певних аспектах щеплені глюкозаміноглікани нагадують протеоглікани, які є істотними компонентами матриксу в тканинах хребетних. Але оскільки ніякі компонувальники білка відсутні в химерних полімерах, то антигенність та проблеми протеолізису, що виникають навколо медичного використання протеогліканів, усунуті. Ризик передачі інфекційних агентів тканинами, витягнутими з тварин, людському пацієнту також зменшено під час використання химерних полімерів.

Таблиця 4. ПмГКС-ініційоване щеплення ГК на бусинки поліакриламіду. Реакційна суміш містить пмГКС, що несе радіоактивну мітку UDP-(14C)GlcUA та UDP-(3H)GlcNAc, а також різні іммобілізовані праймери цукрів (акцептори, з'єднані відновлювальним амінуванням в амінобусини) були представлені. Бусинки були промиті та радіоактивно інкорпоровані на інші намистини, виміряні методом розрахунку рідинної сцинтиляції. ГК ланцюга були щеплені на пластикові намистини при використанні відповідного праймера та пмГКС.

Ілюстрація 4. Схематичне зображення щеплених полісахаридних структур. ГК синтазу виду Pasteurella або хондроїтин синтазу будуть подовжувати певні інші полімери на кінці, що не відновлюється in vitro, щоб сформувати нові химерні глюкозаміноглікани. Зображено деякі приклади.

Синтез монодисперсної ГК та ГК-пов'язаних олігосахаридів

Крім додавання великої полімерної ГК ланцюга до молекул акцептора, пмГКС синтезують певні менші ГК олігосахариди в діапазоні від 5 до 24 цукрів. Використовуючи фермент дикого типу та різні умови реакції, відносно легко отримано ГК олігосахарид, що містить 4 або 5 моноахаридів, подовжених декількома цукрами до більш довгих версій, які дуже часто важко отримати у великих кількостях. Ми з'ясували, що комбінуючи розчинний мутант GlcUA-Tase і розчинний мутант GlcNAc-Tase в тій же суміші реакції дозволяє формування ГК полімеру, якщо система забезпечена акцептором. Протягом 3-х хвилин був зроблений ланцюг приблизно з 150 цукрів (-30 кДа). Будь-яка одиночна мутант-синтаза не сформує в результаті ланцюг ЦК. Тому, якщо подальший контроль реакції зроблено шляхом вибіркового комбінування різних ферментів, UDP-цукорів та акцепторів, то можуть бути отримані певні монодисперсні олігосахариди (рис. 5).

5. Приготування певних олігосахаридів.
У цьому прикладі, акцептор ГК тетрасахарид подовжується одиночною хондроїтином дисахаридною одиницею, використовуючи два кроки з іммобілізованим мутантом синтази виду Pasteurella (показано білими стрілками). Зображений продукт є новим гексасахаридом. Повторення циклу ще раз виробляє олігосахарид, два цикли формують декасахарид, і т.д. Якщо акцептор був раніше з'єднаний з іншою молекулою (наприклад препарат або ліки), тоді новий кон'югат був би подовжений коротким ГК, хондроїтин або гібридним ланцюгом як і бажано.

Наприклад, в одному втіленні суміш UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA та акцептора постійно циркулює через окремі біореактори з іммобілізованими мутант-синтазами, які передають тільки одиночний цукор. З кожним циклом інкубації біореактора інша цукрова група додається до акцептора, щоб сформувати певні маленькі ГК олігосахариди. Використання схожого пмЦС мутанта (наприклад, GalNAc-Tase) в одному з кроків дозволило відбуватися формуванню змішаних олігосахаридів при використанні UDP-GlcNAc. Біологічна активність та терапевтичний потенціал маленьких ГК олігосахаридів – складна галузь для дослідження, яка вимагатиме певних, монодисперсних цукрів для однозначної інтерпретації.

Висновок

Очевидно, існують два різні класи ГК синтаз. Найбільш добре охарактеризований фермент класу II виду Рasteurella, що подовжує ланцюг ГК повторюваним приєднанням одиночного цукру на кінець ланцюга ГК, що не відновлюється. Напрямок та спосіб роботи синтаз класу I (стрептококові, вірусні та ферменти хребетних) залишаються неясними. Щодо прикладних наук, здатність пмГКС подовжувати екзогенно розташовані акцепторні молекули корисна для створення нових молекул та/або пристроїв з потенційним медичним застосуванням.

Структура

Молекула гіалуронової кислотисхожа на довгу стрічку, побудовану з цукрів, що чергуються - D-глюкуронової кислоти і N-ацетилглюкозаміну. утворюють базову дисахаридну одиницю ( Рис. 1).

Рис.1. Гіалуронова кислота складається з дисахаридних одиниць, що чергуються.

В одному ланцюжку може бути до 250 тисяч дисахаридних одиниць. Молекулярна маса цього природного полісахариду досягає 10 тисяч кДа. ГК входить до складу синовіальної рідини, склоподібного тіла, зустрічається в пупковому канатиці, рогівці, кістках, клапанах серця, оболонках яйцеклітин.

Принципово важливою є властивість гіалуронової кислоти(ГК) зв'язувати та утримувати (за рахунок водневих зв'язків) велику кількість води: 1 молекула ДК пов'язує 200-500 молекул води. При цьому вона має ефект «памперса» - не віддає воду навіть при зменшенні її вмісту у навколишньому середовищі. Висока щільність негативних зарядів, що утворюються при дисоціації карбоксильних (кислотних) груп, притягує масу катіонів, таких як іони Na+, які є осмотично активними та зумовлюють надходження в матрикс ще більшої кількості води. Високий тиск набухання, що формується при цьому, і є те, що ми називаємо тургором. Тургор дерми, що визначається змістом та властивостями ЦК, забезпечує тургор .

Оскільки в молекулі є як гідрофільні, так і гідрофобні ділянки, у розчинах високомолекулярна ГК (М.м > 1000 кДа) набуває просторової структури у вигляді хаотично закрученої стрічки, яка у тривимірному просторі утворює пухкий клубок. Такі клубки займають величезний обсяг (у тисячі разів більший, ніж обсяг самих макромолекул!), утворюючи в'язкий гель навіть за дуже низької концентрації.

Просторові мережі, що формуються, з осередками певного розміру забезпечують «природний відбір» циркулюючих молекул. Таке природне «молекулярне сито» вільно пропускає іони, цукру, амінокислоти, сигнальні молекули, але затримує (і накопичує) великі молекули, зокрема й різні токсини.

Метаболізм

Синтез ГК відбувається на внутрішній поверхні плазматичної мембрани фібробластів. Молекули моноцукорів, з яких вишиковується полімерний ланцюжок, утворюються з глюкози, донором аміногрупи є глутамін. У міру формування макромолекула виводиться назовні ( Рис. 2).

Рис.2. Синтез глікозаміноглікатів фібропластами (по H. Heine, 1997)

Синтез ГК каталізується ферментом гіалуронатсинтетазою (HAS), представленою трьома різновидами (Itano N.):

  • HASi - здійснює повільний синтез ланцюгів з М.м близько 200-2000 кДа,
  • HAS2 - відповідає за швидкий синтез високомолекулярної ГК із М.м. більше 2000 кДа),
  • HAS3 - найактивніший з ферментів, що у синтезі ДК з М.м. близько 200-2000 кДа.

Гіалуронової кислоти в дермі синтезується набагато більше, ніж катаболізується. Виявляється, значна її частина призначена для дренування через лімфатичну систему, що є важливим механізмом детоксикації тканини, адже разом з нею видаляються 8 молекулярних «мереж» екзо- і ендотоксини, що «заплуталися». У лімфатичні судини здатні проникати навіть великі ланцюги ГК із М.м. близько 1000 кДа.

Катаболізм ДК носить ступінчастий характер, і йому надається велике значення у регуляції стану матриксу. В даний час біотрансформацію ГК розглядають як найважливіший фактор підтримки гомеостазу та один з універсальних механізмів розвитку патологічних процесів (запалення.пухлинної інвазії та метастазування), адже у міру зменшення довжини вихідного ланцюжка утворюються фрагменти з власною біологічною активністю. Таблиця 2).

Катаболізується ГК за участю гіалуронідаз (I та II типу), що каталізують реакції гідролізу та деполімеризації (позаклітинна деградація). Дрібні фрагменти частково фагоцитуються макрофагами і піддаються подальшому катаболізму за участю лізосомальних ферментів (3-глюкуронідази і (3-ацетилглюкозамінідази (внутрішньоклітинна деградація). 90% ГК, що потрапила в периферичний лімфоток, 9 у селезінці.

В організмі дорослої людини вагою 70 кг у складі всіх органів та тканин сумарно міститься близько 15 г гіалуронової кислоти, причому 50% припадає саме на шкіру.
Щодня близько 5 г ДК руйнується і знову синтезується, тобто час життя цього молекули обмежується кількома днями. ГК - найшвидше оновлюваний компонент позаклітинного матриксу. Для порівняння: «тривалість життя» зрілого колагенового волокна – кілька місяців, волокна еластину взагалі відносяться до практично неоновлюваних структур.

Таблиця 2.Біологічні функції молекул гіалуронової кислоти з різною молекулярною масою (Stern R et al, 2006)

Довгі ланцюги із М.м.
близько 500 кДа

Пригнічують ангіогенез, перешкоджають міграції та поділу клітин, можливо за рахунок зміни міжклітинної взаємодії, інгібують продукцію цитокіну IL-1b, простагландину Е2, мають імуносупресивну дію.

Молекули з масою
20-100 кДа

Стимулюють міграцію та поділ клітин, сприяють загоєнню ран, забезпечують цілісність епітелію, беруть участь у овуляції та ембріогенезі.

Короткі ланцюги ГК із М.м.
менше 0.4-10 кДа

Стимулюють ангіогенез, мають імуномодулюючу та протизапальну дію.

Тетрасахариди

Мають антиапоптотичними властивостями, стимулюють синтез білків теплового шоку.

ГК у житті клітинної спільноти

ЦК входить до складу не тільки , але і багатьох інших органів та тканин. І лише на рівні всього організму регуляція її біосинтезу фібробластами здійснюється нейроэндокринной системою. Важлива роль належить гормону передньої частки гіпофізу - соматотропіну, який стимулює поділ та синтетичну активність клітин сполучної тканини. Кортикотропін та глюкокортикоїди (кортизон, гідрокортизон) пригнічують розподіл фібробластів, сприяють їх «прискореному старінню», що супроводжується зменшенням синтезу колагену та гіалуронової кислоти. Мінералокортикоїди (альдостерон, дезоксикортикостерон), навпаки, стимулюють утворення ГК. Аналогічний ефект мають естрогени (див. Додаток «ГК в організмі людини: цікаві факти»).

У дермі підтримання рівня ДК забезпечується механізмами ауторегуляції за принципом зворотного зв'язку ( схема 2).

Взаємодія ГК із клітинами відбувається за участю специфічних білків-гіаладгеринів, які можуть бути як елементами рецепторного апарату клітин (RHAMM, IHABP), так і позаклітинними структурами, до яких відносяться верзикан, аггрекан, фібриноген, колаген VI типу (див. Додаток «Взаємодія ГК з рецепторами – механізм реалізації її біологічної активності»).

На цьому самому місці варто, мабуть, зупинитися та замислитися. З чим пов'язане таке широке поширення ГК в організмі людини? І у тваринному світі взагалі? Чим визначається різноманіття механізмів регулювання її метаболізму? Чому принаймні деградації біологічна активність не зникає, а видозмінюється? Узагальнюючи все сказане вище і заглядаючи вперед, можна припустити: відповідь криється в різноманітті біологічних функцій цього унікального біополімеру. таблиця 3).

Таблиця 3. Біологічна роль гіалуронової кислоти

Є основою гідратованого міжклітинного матриксу - фізіологічного середовища для міграції, поділу та диференціації клітин.

Регулює синтетичну активність фібробластів, у тому числі позаклітинний етап синтезу колагену.

Має опосередковану імуномодулюючу дію (як стимулюючи, так і пригнічуючи імунітет).

Забезпечує транспорт поживних речовин та сигнальних молекул від кровоносних судин до клітин, а також виведення продуктів життєдіяльності.

Сприяє дренажу та детоксикації сполучної тканини, є «пасткою» для вільних радикалів.

Забезпечує регенерацію тканин та репарацію пошкоджень (пластична функція).

Бере участь у регуляції ангіогенезу.

Регулює морфогенез тканин у період ембріонального розвитку.

ГК та старіння

Питання, чи змінюється з віком вміст ДК у шкірі, залишається дискусійним. Проте відомо точно, що з старіння організму дедалі більше ДК перетворюється з вільного стану пов'язане (з білками). При цьому вона частково втрачає свої унікальні здібності, а саме: інгібувати реакції вільно-радикального окиснення, залучатися до метаболічного шляху та стимулювати фібробласти, залучати та утримувати воду. За рахунок зниження вмісту води шкіра втрачає пружність, її гладкий рельєф деформується зморшками і складками.

У косметології найбільший успіх мають ін'єкційні процедури – контурна пластика, біоревіталізація, біорепарація. Активним компонентом препаратів, що застосовуються для виконання, є гіалуронова кислота (ГК). Незважаючи на неоднозначні висловлювання у ЗМІ, гіалуронова кислота в косметології не втрачає своєї популярності вже протягом двох десятків років.

Роль ГК в організмі людини

Усі системи та органи складаються з клітин: кров – з формених елементів, печінка – з гепатоцитів, нервова система – з нейронів. Простір між усіма клітинами займає сполучна тканина, що становить близько 85% всього організму. Будучи єдиною структурою, вона взаємодіє зі всіма іншими тканинами (епітеліальної, нервової, м'язової тощо) і здійснює їхній взаємозв'язок між собою.

Сполучна тканина, залежно від її складу, може бути в різних фізичних станах - у рідкому (кров, лімфа, синовіальна внутрішньосуглобова та спинномозкова рідина), твердому (кістка), у вигляді гелю (міжклітинна рідина та хрящ, склоподібне тіло ока). Найбільш повно вона присутня в шкірних структурах – дермі, гіподермальному та базальному шарах.

Сполучну тканину від інших тканин організму відрізняє висока розвиненість її основи за відносно невеликої кількості структур клітин. Основа складається з еластинових та колагенових волокон, а також складних молекулярних білкових та амінокислотних сполук з аміносахарами. Найважливішим із них і є гіалуронова кислота.

Одна молекула ГК здатна пов'язувати близько 500 молекул води. У людини середнього віку вона синтезується фібробластами у кількості 15-17 грн. Половина її міститься в клітинах рогового шару шкіри, а також між волокнами еластину та колагену. Вона стимулює вироблення цих білків, створює умови для їх фіксованого розташування, надаючи цим пружність та еластичність кожному покриву.

Відео

Процеси старіння тканин

Під впливом ферменту гіалуронідази гіалуронова кислота руйнується. Процеси її відновлення та розщеплення відбуваються безперервно. Близько 70% руйнується та відновлюється протягом доби. Переважання того чи іншого процесу залежить від:

  • добових та сезонних біоритмів;
  • віку;
  • психологічний стан;
  • нераціонального харчування;
  • нікотинової інтоксикації та надлишкового УФ опромінення;
  • прийому певних медикаментозних препаратів та ін.

Ці чинники впливають як синтез ГК (гіалуронату), а й у його структуру. Зниження його кількості призводить до зменшення пов'язаної води в тканинах та появи ознак їх старіння. Дефектні молекули зберігають здатність зв'язувати воду, але втрачають здатність віддавати її. Крім того, природні вікові процеси призводять до концентрації ГК у глибоких шкірних шарах, що є причиною міжклітинного набряку тканини на межі дерми та гіподерми та зневодненості більш поверхневих шарів.

Всі ці процеси зі збільшенням віку і під впливом негативних факторів наростають і призводять до сухості шкіри за одночасної одутлості обличчя та набряків під очима, зниження її еластичності та пружності, появи зморшок та пігментації.

Види ГК в організмі

Унікальність її полягає в наявності молекул із різною довжиною ланцюжка полісахаридів. Від довжини ланцюжка багато в чому залежать властивості гіалуронової кислоти та її вплив на клітини:

  1. Молекули з коротким ланцюгом, або низькомолекулярна гіалуронова кислота – має протизапальну дію. Цей вид кислоти застосовується з метою лікування опікової хвороби, трофічних виразок, вугрів, псоріазу та герпетичних висипань. Вона використовується в косметології у вигляді одного з компонентів тоніків та кремів зовнішнього застосування, оскільки, не втрачаючи своїх властивостей, довго і глибоко проникає у шкіру.
  2. Середньомолекулярна ГК, що має властивість придушення міграції, розмноження клітин та ін. Вона використовується при лікуванні очей та деяких видів артритів.
  3. Високомолекулярна - стимулює клітинні процеси в шкірі і має властивість утримувати велике число молекул води. Вона надає шкірі пружність та високу стійкість до зовнішніх негативних факторів. Цей вид використовується в офтальмології, хірургії, а в косметології – у препаратах для ін'єкційних методик.

Промислові види

Залежно від технології виробництва гіалуронат натрію поділяється на два види:

  1. Тривалий час застосовувалися препарати з гіалуроновою кислотою тваринного походження. Її отримували шляхом ферментативного розщеплення подрібнених частин тварин (очі та хрящі великої рогатої худоби, півнячі гребені, синовіальна внутрішньосуглобова рідина, пуповини) в результаті спеціальної двоетапної очистки та осадження. Технологія передбачала використання дистильованої води та високої температури (85-100 градусів). Значна частина високомолекулярної фракції руйнувалася, перетворюючись на низькомолекулярну. Крім того, залишалися білки тваринного походження.

    Ефект після ін'єкцій таких препаратів з метою косметичної корекції особи зберігався недовго, іноді сприяв утворенню дермальних вузлів. Але препарат особливо небезпечний тим, що часто ставав причиною виражених запальних та алергічних реакцій через наявність тваринного білка. Тому така технологія вже майже не застосовується.

  2. З недавнього часу у фармацевтичній промисловості ГК одержують способом біотехнологічного синтезу. З цією метою використовуються мікроорганізми (стрептококи), вирощені на пшеничному бульйоні. Вони виробляють гіалуронову кислоту, яка на наступних етапах очищається, висушується і піддається багаторазовому бактеріологічному та хімічному дослідженням. Такий препарат майже повністю відповідає кислоті, що виробляється в організмі людини. Він майже не викликає алергічних та запальних реакцій.

Застосування у косметології

Гіалуронова кислота застосовується для введення в шкіру та підшкірні шари за допомогою різних способів:

  1. Ін'єкційні.
  2. Безін'єкційні.

Ін'єкційні процедури з гіалуроновою кислотою застосовуються в таких методиках, як:

  • і - введення препарату в середні шари шкіри; застосовується при вікових змінах, сухості шкірного покриву та для підвищення його еластичності, тонусу та кольору, усунення вугрового висипу, розтяжок тощо; тривалість збереження гіалуронової кислоти в дермі – до 14 діб;
  • - заповнення речовиною підшкірних структур з метою розгладження зморшок та корекції контурів особи; препарат зберігається під шкірою протягом 1-2 тижнів;
  • та - введення модифікованої гіалуронової кислоти, яка зберігається у шкірі до 3 тижнів.

Запитання

Що краще: ботокс чи ГК?

Враховуючи різноспрямованість механізмів дії ботоксу та гіалуронової кислоти, вони застосовуються для досягнення різних ефектів. Можливе їхнє поєднання. Однак слід пам'ятати про те, що після введення має пройти щонайменше два тижні.

Чи можна поєднувати введення колагенових філерів та ГК?

Добре поєднуються філери на основі колагену та ГК. Перший забезпечує шкірі щільність і структуру та діє в середньому 4 місяці, другий – природне зволоження та міцність протягом 6-9 місяців.

Будь-яке застосування ін'єкцій гіалуронової кислоти має здійснюватися лише лікарем-косметологом.

Гіалуронова кислота було відкрито 1934 року, перші ж детальні її дослідження почали проводитися 1949 – 1950 роках. Ця речовина була виділена з різних тканин тварин - суглобової рідини, пуповини та тканин півнячого гребеня. Крім того, в 1937 році гіалуронову кислоту вдалося отримати з капсул стрептококів. Перші дослідження фізичних та хімічних властивостей гіалуронової кислоти проводились методом рентгенівської кристалографії.

Проблеми отримання ЦК

Основною проблемою при дослідженні гіалуронової кислоти, з якою зіткнулися вчені, була складність її виділення у чистому вигляді, очищеної від білків та інших компонентів. Труднощі виникали тому, що завжди мав місце ризик руйнування полімерної структури гіалуронової кислоти в процесі очищення. При цьому вчені випробували різноманітні методи фізичного, хімічного та ферментативного очищення.

Трохи пізніше почалися дослідження можливості біосинтезу гіалуронової кислоти. У 1955 році такий спосіб уперше було знайдено. Група вчених виділила молекули гіалуронової кислоти з екстракту стрептококів. Завдяки цьому відкриттю стало можливим синтезувати гіалуронову кислоту - використовуючи ферментативну фракцію, взяту зі стрептококів.

Гіалуронова кислота - Застосування

Головний прорив у застосуванні гіалуронової кислоти стався у 50-ті роки. Завдяки відкриттю цієї речовини для використання в медицині, було розпочато його промислове виробництво та популяризація як лікарський засіб.

У 1970 році гіалуронова кислота була затверджена, як доведено ефективний засіб від артритів – після отримання позитивних результатів тестування на тваринах. В результаті проведеного досвіду було відзначено виражений клінічний ефект із зменшенням симптомів.

Кількома роками пізніше гіалуронову кислоту почали використовувати у складі внутрішньоочних лінз, що імплантуються, що швидко зробило її одним з найбільш часто використовуються компонентів в хірургічній офтальмології. З цього моменту стали пропонуватися і випробовуватися різні способи та галузі застосування гіалуронової кислоти.

ЦК на сьогоднішній день

У 90-ті роки гіалуронова кислота знайшла широке застосування в естетичній медицині та косметології, завдяки своїм унікальним вологоутримуючим, а також антисептичним та антиоксидантним властивостям. На сьогодні вона використовується в різних косметологічних цілях, а дослідження її властивостей та можливих областей застосування продовжуються.

Сьогодні згадками про гіалуронову кислоту рясніють як глянсові видання, так і сторінки звичайних ЗМІ. Останні кілька років нам не перестають стверджувати, що "секрет вічної молодості шкіри розкритий" і пропонують скористатися цим "еліксиром". Давайте спробуємо розібратися, чого в цьому хворому ажіотажі більше - правдивої інформації, точного комерційного розрахунку або банальних обивательських помилок.

Відкриття минулого, які не виправдали надій

Якщо зазирнути у зовсім недавнє минуле, можна згадати, що аналогічні ситуації вже були в історії медицини:

  • Відкриття пеніциліну підносилося, як повна перемога над мікроорганізмами (чого, на превеликий жаль, не відбулося, незважаючи на теперішній спектр).
  • Інсуліну, що випускається, пророкували перемогу над (препарат для діабетиків життєво важливий і вкрай необхідний, але до повної перемоги над діабетом ще дуже далеко).
  • Використання перших нейролептиків підносилося, як можливість лікування певних розладів психіки, але й тут все далеко від ідеальних очікувань.

Загалом, справжня картина після деякого часу все-таки відрізняється від прогнозів і початкових оцінок. Тому дуже важливо ставитися до всього критично та максимально об'єктивно.

Розвінчуємо міфи про гіалуронову кислоту

Ніхто з медиків не буде сперечатися, що гіалуронова кислота важлива для організму людини, але та безліч інформації, яку сьогодні можна зустріти у ЗМІ і яка видається за істину, на жаль, приходить до нас не від професіоналів. Найчастіше новаторські думки в народ несуть різноманітні б'юті-експерти, блогери-самоуки та інші люди без профільної – медичної, фармацевтичної чи біологічної освіти. Вони висловлюються про медичний препарат на підставі власних оціночних вражень, інформації із сумнівних джерел або інформації, вирваної з контексту

Так народжуються помилки. Давайте спробуємо відокремити зерна від полови і розібратися в цьому питанні більш детально.

Істина

Головна помилка в тому, що препарат називають в однині, а правильно називати в множині - кислоти, так як це одна з сполук групи кислих мукополісахаридів, куди входять і інші сполуки аналогічного складу і властивостей, причому маса їх може коливатися в широких межах. Так як переважна більшість препаратів, що виходять під назвою «гіалуронова кислота», виробляється з біологічної сировини без спеціального поділу фракцій, то і вважати препарат саме однією чистою сполукою зовсім некоректно.

Гіалуронова кислота – результат відкриттів б'юті-лабораторій останніх двох-трьох десятиліть.

Сама речовина була відкрита ще в 1930 році і вивчення її властивостей, функцій, а також можливостями застосування зайнялися практично відразу після відкриття. Самі дослідження не припинялися, а починаючи з 70-х років минулого століття їхня інтенсивність стала наростати.

Дана речовина використовується в косметичній та косметологічній продукції

Крім цього розвиненого напрямку гіалуронова кислота застосовується при різних захворюваннях інших органів та систем як лікарський засіб.

У косметологічних засобах покращує проникнення корисних речовин усередину шкіри.

Не впливає на рівень клітинної та міжклітинної проникності для різних речовин

Старіння шкіри пов'язане зі втратою рідини через зменшення рівня речовин цієї групи у всіх шарах шкіри

Якщо зниження вмісту гіауронатів і відбувається з віком, то не настільки значно, а старіння, у тому числі й шкіри, - найскладніший багатогранний загальнобіологічний процес і зводити його прояви до таких банальних причин - просто безглуздо

Правда про гіалуронову кислоту

Всі властивості та характеристики та відмінні особливості гіалуронової кислоти докладно описуються у науковій та медичній літературі. Проте вона пересичена безліччю термінів, що робить наявну інформацію який завжди зрозумілою простого обивателя.

Якщо спробувати дещо спростити – виходить що:


Для кожної з фракцій властивий свій набір властивостей та характеристик. Так низькомолекулярні різновидиречовини мають прекрасну протизапальну дію, що забезпечило їх застосування при опіках, трофічних виразках, герпетичних висипаннях, псоріазі. . Середньомолекулярна гіалуронова кислотаздатна пригнічувати розмноження клітин та його міграції. Завдяки цим властивостям її залучають при лікуванні деяких артритів та хвороб очей. Високомолекулярні фракціїутримують навколо себе безліч молекул води і стимулюють клітинні процеси в самій шкірі. Цей різновид гіалуронової кислоти знайшов своє застосування в хірургії, офтальмології та косметології.

Важливо знати! Використовувати препарат із невказаною величиною молекул діючої речовини категорично не можна, тому що можна не тільки не досягти бажаного результату, але й погіршити стан.

Основні показання до застосування гіалуронової кислоти

Завжди слід пам'ятати, що введення в організм препаратів гіалуронової кислоти ін'єкційноє насамперед медичною маніпуляцією. Для використання різних методик та проведення процедур є досить суворі медичні критерії.

Так, основними показаннями до застосування гіалуронової кислоти є:

  • поява зморшок (зниження тургору шкіри) внаслідок втрати вологи;
  • збільшення виразності наявних зморшок;
  • виражені мімічні зморшки;
  • необхідність нормалізації рельєфу шкіри;
  • необхідність поліпшення тургору та контуру червоної облямівки губ.

Препарати гіалуронової кислоти в естетичній медицині

У сучасній косметології затребуваність гіалуронової кислоти у вигляді уколів чи інших форм препарату пояснюється:


Сучасний фармакологічний ринок пропонує гіалуронову кислоту як ін'єкцій. При цьому вона може бути у вигляді:

  • Мезококтейль, що включає в себе основну речовину, доповнену пантенолом, вітамінами, коензимами, факторами клітинного росту, пептидами та ін.
  • Філлерів– дермального наповнювача зі зшитої ГК, який згодом біодеградує – розсмоктується в організмі. Випускається у вигляді гелю різного ступеня в'язкості. Чим більш в'язка речовина, тим з великими проблемами вона має впоратися.
  • Редермалізантів та біоревіталізантів. В даний час на прилавках аптек можна знайти 3 покоління цих препаратів. В основі останніх – нуклеїнові кислоти, що створюють з ГК комплекси, здатні відновлювати ДНК клітин та прискорювати вироблення власної гіалуронової кислоти, а також еластину та колагену.
  • Біорепарантів- Препаратів, що містять змінену ГК, до ланцюга якої прикріплені пептиди, вітаміни, амінокислоти. Вони мають пролонговану і посилену дію.

Зверніть увагу: в індустрії краси можуть бути задіяні мазі, креми, гелі, лосьйони для зовнішнього застосування, але їх ефективність набагато нижча за ефективність гіалуронової кислоти для ін'єкцій.

Основні типи процедур для покращення стану шкіри обличчя

Найбільш затребуваними ін'єкційними процедурами з гіалуроновою кислотою стали:


Основні протипоказання до застосування гіалуронової кислоти

Якщо маркетологи намагаються вас запевнити, що уколи гіалуронової кислоти, куди б вони не здійснювалися, максимально безпечні, знайте: це брехня! На тлі певних процедур вони дійсно безпечніші, однак і цей препарат має власні протипоказання.

До основних відносяться:

  1. Будь-які алергічні реакції на діючу речовину або її компоненти.
  2. Будь-які інфекційні захворювання у гострому періоді.
  3. Вагітність, пологи та подальша лактація.
  4. Патологія сполучної тканини.
  5. Загальні та системні захворювання, такі як аутоімунні ураження, онкологічна патологія будь-яких органів і систем, цукровий, патологія системи згортання крові.

До того ж, у місці ін'єкцій не повинні розташовуватися родимі плями, родимки, шрами та запальні процеси. При недотриманні цих протипоказань результати можуть бути плачевними.

Ефективність кремів із гіалуроновою кислотою

Окрему групу препаратів, причому досить поширених, складають креми з гіалуроновою кислотою. Їх застосовують шляхом нанесення на поверхню шкіри, де вони справляють безпосередній ефект.

Для поверхневих змін захисту шкіри використовуються засоби, що містять високомолекулярні фракції, які створюють захисний шар і не проникають всередину шкіри.

Для коригування глибоких, вікових змін краще підходять засоби з низькомолекулярними фракціями діючої речовини, так як воно частково може проникати на певну глибину у внутрішні шари, де здійснюється їх біологічна дія.

Все більшої популярності останнім часом набувають безін'єкційні методики, що передбачають нанесення гелю на шкіру з подальшим впливом мікрострумів, лазера, ультразвуку.

Хочеться закінчити порадою: для всього є свій час та свої причини, а основне правило здорового життя, відмінного настрою та прекрасної зовнішності – це поміркованість. У гонитві за красою намагайтеся використовувати навіть такий засіб, як гіалуронова кислота, без надмірностей, і ваша шкіра виглядатиме добре навіть у глибокій старості.

Більш детальну інформацію про застосування препаратів гіалуронової кислоти для особи ви отримаєте, подивившись відео-огляд:

Совінська Олена Миколаївна, терапевт.